1536年的英格蘭，國王亨利八世的第二任妻子安妮·博林（安娜）生下了未來的伊麗莎白一世女王，但未能為國王生下兒子和繼承人。國王的目光轉向了安妮的侍女簡·西摩（喬凡娜）。

第一幕

場景一：王后的處所

朝臣們討論王室事務。安娜召喚了喬凡娜並承認她感到困擾。王后要求她的侍童史密頓唱一首歌讓大家高興起來，但這首歌讓安娜想起了她的初戀，她當年便為了嫁給國王而背叛了初戀。安娜和其他人離開，留下了國王的新情人 — 充滿罪惡感的喬凡娜獨自一人。亨利進來表白了他對喬凡娜的愛情，並承諾結婚。

場景二： 溫莎園林

安娜的兄弟羅斯科勳爵驚訝地遇見從外地被召回的里卡多，里卡多是王后的前任情人，曾被國王放逐海外。他詢問關於安娜的近況，羅斯科對此避而不談。

亨利帶著狩獵隊到來。安娜和她的侍女們跟隨。亨利冷冷地向里卡多打招呼，告訴他此次赦免全為安娜的功勞。可是，亨利召回里卡多的背後，設下了圈套。

場景三：王后處所附近

暗戀著王后的侍童史密頓前來歸還他早前偷取的墜飾盒，裡面藏有安娜的肖像。當安娜和羅斯科出現時，他躲了起來。羅斯科希望安娜說服里卡多遠離英格蘭以避風險。仍然愛著安娜的里卡多進來。儘管安娜告訴里卡多國王現在討厭她，但仍敦促他離開英格蘭。當安娜拒絕再見里卡多時，他拔劍意圖自殺。史密頓以為安娜有危險，便衝出去與里卡多對峙。羅斯科回來警告國王即將到來。亨利突然闖入。史密頓宣稱王后是無辜的，但國王搶走了墜飾盒作為妻子不忠的證據，並逮捕了安娜。

第二幕

場景一：倫敦，王后處所的前廳

安娜被囚禁在她的處所裡；守衛注意到喬凡娜也避開了她。安娜的女侍們焦急地等待審判結果，又告訴她要信任上天的安排。女侍們被傳喚到貴族議會作證。喬凡娜偷偷告訴安娜，只有承認通姦讓國王與她離婚才能避免死亡。安娜駁斥了喬凡娜，但認為背叛了自己的人是國王亨利，而不是喬凡娜。

場景二：貴族議會廳外

史密頓相信自己招認便能拯救安娜，於是謊稱自己是王后的情人之一。安娜說她已準備好赴死，但懇求不要遭受審判的恥辱。里卡多辯稱他和安娜早在她成為國王的妻子前已經結婚，這正中國王的下懷，下令將兩人一同帶走。

喬凡娜向議會娜懇求放過安娜一命，但議會的裁決宣稱此王室婚姻已經解除，安娜和她的同夥將被處決。

場景三：倫敦塔

里卡多和羅斯科一起被關在牢房裡。決心為安娜陪葬。同時，安娜在牢房裡神智不清，幻想今天是她與國王結婚的日子，又回憶起她與里卡多的初戀，最後想到了她在家裡的童年。安娜在牢房的同窗都被帶了進來。史密頓責怪自己；安娜卻問他為什麼不彈琴歌唱。宣布國王新婚的砲聲一響，安娜便回過神來。儘管自己被蒙上可怕的罪行，安娜表示她不希望向國王和喬凡娜報仇，最後從容面對處決。